HPLC法測定炔雌醇脂質體的含量及包封率論文
目的 建立測定炔雌醇脂質體的含量及包封率的方法。方法 采用HPLC法，以Agilent HC?C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)為色譜柱，流動相為甲醇?水(體積比70∶30)，柱溫為室溫，流速為1.0 mL·min-1，紫外檢測波長為281 nm。結果 炔雌醇與卵磷脂、溶劑峰能有效分離，炔雌醇在2 ～20 μg·mL-1范圍內線性關系良好（r=0.999 7, n=10），回收率在98.0%～102.0%之間。結論 所建立的方法簡便、準確、靈敏度高、方法可靠，可作為炔雌醇脂質體的含量及包封率的質量控制方法。Abstract:Objective To establish an HPLC method for the analysis of ethinylestradiol content and entrapment efficiency of ethinylestradiol liposomes.Method Samples were analyzed on an Agilent HC?C18 column（4.6 mm× 250 mm，5 μm）using methanol?water（70∶30）as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1 and detection wavelength 281 nm.Results Ethinylestradiol had a good linearity over the range of 2～20 μg·mL-1 (r=0.999 7, n=10), the average recovery was between 98.0% and 102.0%. Conclusion This method is simple, accurate and sensitive for the quality control of the liposomes.
Key words:HPLC; ethinylestradiol liposomes; ethinylestradiol; entrapment efficiency
炔雌醇又名乙炔雌二醇，為3?羥基?19?去甲?17α?孕甾?1，3，5（10）?三烯?20?炔?17?醇。化學結構式為［1］：
炔雌醇作為雌激素類藥，其對下丘腦和垂體有正、負反饋作用，小劑量時可刺激促性腺素分泌，其活性是雌二醇的7～8倍，己烯雌酚的20倍，臨床多用于月經紊亂，如閉經、月經過少、功能性子宮出血、絕經期綜合征、子宮發育不全、前列腺癌等疾病的治療，具有療效確切、價格適中等優點，易被廣大婦女所接受。但其亦有許多副反應，如惡心、嘔吐、陰道出血、誘發子宮內膜癌等［2,3］，因而嚴重地影響到病人的用藥安全。將其制備成脂質體，可以有效地減少給藥次數和給藥量，提高生物利用度，降低毒副作用。
本文制備了炔雌醇脂質體，并采用反相高效液相色譜法測定炔雌醇脂質體的含量和包封率［4,5］。實驗結果表明，該方法準確可靠，可作為炔雌醇脂質體質量控制的一個有效手段。
1 儀器與試藥
Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996紫外檢測器，Waters 717自動進樣器，Waters Millennium色譜工作站；Agilent HC?C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm) 色譜柱；日立U?3010/3310紫外可見分光光度計(北京天美公司)；Nicomp 370激光散射粒徑儀（ 加拿大Santa Burbara公司），擠壓器(加拿大Lipex Biomembranes公司) 。甲醇(色譜純，SK Chemicals)；炔雌醇原料藥（上海醫藥集團有限公司）；精制蛋黃卵磷脂egg phosphatidylcholine (西安力邦制藥有限公司，質量分數98%) 。
2 方法與結果
2.1 脂質體的制備
采用薄膜法制備炔雌醇脂質體［6-8］：按藥物含量15%～30%（摩爾比）稱取炔雌醇原料藥和蛋黃卵磷脂，將其溶于適量甲醇?氯仿（體積比1∶2）中，漩渦混合均勻后，50 ℃下氮氣吹干，再用真空泵將剩余有機溶劑抽干。加入磷酸鹽緩沖液漩渦混合，高速剪切1～2 h，用脂質體擠壓器將其依次經過400、200、100 nm聚碳酸鹽濾膜擠壓，即得。獲得的脂質體的平均粒徑都在110 nm左右，電鏡觀察，呈現均勻的圓球狀。
2.2 色譜條件
色譜柱：Agilent HC?C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；流動相：甲醇?水(體積比70∶30)；柱溫：室溫；流速為1 mL·min-1；紫外檢測波長為281 nm；進樣量50 μL。
2.3 干擾試驗
稱取20 mg炔雌醇置10 mL容量瓶中，加入甲醇?水（體積比70∶30）溶解并稀釋至刻度，得炔雌醇對照品溶液。分別精密吸取空白脂質體及炔雌醇脂質體各0.2 mL，用甲醇?水（體積比70∶30）稀釋至2.0 mL破乳，振蕩混勻，分別得到空白脂質體溶液和脂質體炔雌醇溶液。將上面制備的3種溶液過0.22 μm有機濾膜，各取50 μL進樣分析，得色譜圖。結果表明，卵磷脂和炔雌醇的保留時間相距很大，卵磷脂對炔雌醇的測定無干擾。炔雌醇對照品和炔雌醇脂質體的峰面積基本相同，證明卵磷脂沒有吸附炔雌醇，也沒有改變炔雌醇的性質和結構，見圖1。
2.4 線性關系考察
取炔雌醇對照品溶液，按上述色譜條件，分別進樣1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 μL，以峰面積（A×10-6）為縱坐標，炔雌醇質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標進行線性回歸，得線性回歸方程：A=0.4026 C-0.4240， r=0.999 7， 結果表明炔雌醇的質量濃度在2～20 μg·mL-1范圍內線性關系良好。
2.5 精密度試驗
取炔雌醇對照品溶液50 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，連續進樣6次，測定炔雌醇的峰面積，計算其RSD值為0.75%，表明該法精密度良好。
2.6 穩定性試驗
取室溫下保存的質量濃度為40 μg·mL-1的對照品溶液于0，6，12，18，24 h分別進樣，記錄峰面積，計算其RSD值為1.08%，表明溶液在室溫放置24 h穩定。
2.6 回收率試驗
精密稱取炔雌醇對照品2.5 mg置50 mL容量瓶中，甲醇?水（體積比70∶30）溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。取計算量的空白脂質體（相當10 mg蛋黃卵磷脂）置1～6號50 mL容量瓶中，分別加入1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL炔雌醇對照品儲備液，用甲醇?水（體積比70∶30）溶解并稀釋至刻度，分別進樣50 μL，在281 nm波長處測定峰面積，每個樣品連續測定5次，代入標準曲線，計算回收率，得平均回收率為100.6%，RSD為1.5%，表明回收率結果良好。
2.7 炔雌醇脂質體含量及包封率的測定
分別精密吸取不同配方的炔雌醇脂質體各0.2 mL，加流動相破乳并稀釋至2.0 mL, 搖勻，作為供試品溶液，取上述溶液各50 μL進樣，記錄色譜圖。按外標法計算供試品溶液中炔雌醇的含量及包封率，不同配方的炔雌醇脂質體中藥物的含量及包封率結果見表1。表1 炔雌醇脂質體中的含量及包封率（略）
3 討 論
3.1 檢測波長的選擇
稱取炔雌醇原料藥、蛋黃卵磷脂、炔雌醇脂質體各適量，加甲醇?水溶解，分別在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果測得在281 nm處炔雌醇原料藥和炔雌醇脂質體都有最大吸收，所以選擇281 nm作為檢測波長。
3.2 流動相的選擇
最初選擇純甲醇溶解炔雌醇脂質體制備樣品溶液，出現大量白色沉淀物，當加入少量純水后，白色沉淀物減少，于是配制不同比例的甲醇?水溶液，當甲醇?水溶液體積比為70∶30時，炔雌醇脂質體溶解澄清。所以采用甲醇?水（體積比70∶30）作為流動相，在281 nm波長處其他成分無干擾影響，靈敏度高，準確性好，色譜峰分離優良，保留時間合適。
.3 在脂質體的制備過程中，最后一個制備步驟是通過聚碳酸鹽膜擠壓脂質體使其達到需求的粒徑，但是隨著藥脂比的不斷增大，有一部分藥物在擠壓時已經析出，沉淀在聚碳酸鹽膜上，未進入脂質體體系，因此在高載藥實驗中，最終含藥量要少于起始加入量。
.4 比較了不同配方的炔雌醇脂質體的包封率。當藥物在脂質體中的含量相對適中時，藥物的包封率非常高，這是由于炔雌醇是脂溶性藥物，在磷脂雙層膜中溶解性能好。但是當制備過程藥物與磷脂的比例增加到一定值以上，炔雌醇的溶解能力下降，所以能夠包裹進脂質體中的藥物達到了一定的飽和。這個分析結果在實驗中得到了驗證，在制備過程中觀察到炔雌醇在擠壓器的濾膜上析出時，所測得的包封率都較低，藥物析出越多，包封率也越低。
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